产品货号：
JN3055
中文名称：
mRNA加帽试剂盒(Cap0结构)
英文名称：
Cap0 Capping System
产品规格：
500U
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒可用于体内或体外翻译前mRNA的加帽和mRNA的5'末端标记。用于体外转录RNA加帽时，反应在1h之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。一次标准的加帽反应可以加帽约10μg RNA，反应可以按比例放大或缩小以满足用户的需要。体外转录(IVT)推荐使用T7体外转录试剂盒。
与未加帽的RNA相比，拥有帽结构的RNA稳定性和翻译效率均得到提高。本试剂盒加帽产生的帽结构为Cap 0'结构，通过2'-O-甲基转移酶可以将“ Cap 0”转化为“ Cap 1”结构。除了m7G外，Cap 1 RNA在5'-第一位核苷酸（N1）上还具有2'-O-甲基，可以进一步提高体内翻译效率和降低mRNA自身免疫原性。
加帽后的RNA可以通过的Poly(A)聚合酶在RNA 3'末端添加poly(A)尾。
牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5'末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1和D12）组成（图1a），D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5'N都是必须的（图1b）。
| 图1.牛痘病毒加帽的结构和作用机理。 | |
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| a．牛痘病毒加帽酶和GTP（红色）、SAH（玫红）的共结晶结构(PDB 4CKB)。该酶由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酶（蓝色）、鸟苷转移酶（橙色）和鸟嘌呤甲基转移酶（米黄色）的功能。 | b．mRNA的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5'–5'三磷酸酯桥连接到mRNA链的5'核苷上组成。Cap-0结构由相邻的RNA链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2’-O-甲基转移酶的参与，该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。 |
该牛痘病毒加帽酶来自于携带牛痘病毒加帽酶基因的E.coli。
在37℃下一个小时内把10pmol (α-32P) GTP掺入一个80个核苷酸（80nt）转录产物所需要的酶量。
| 组分 | 规格 |
| Vaccinia Capping Enzyme(10U/μL) | 50μL |
| 10×Capping Reaction Buffer | 100μL |
| GTP (10mM) | 50μL |
| SAM (32mM) | 10μL |
| RNase-Free Water | 1mL |
保存：-20℃，避免反复冻融。
20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.1% TritonX-100，50%甘油。
1×Capping Buffer，37℃孵育。
1×Capping Buffer：
50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM DTT。
无大肠杆菌DNA残留、无核酸内、外切酶残留及RNA酶残留。
- SAM：需事先计算好SAM的用量，在反应开始前把分装的32mM的储备液稀释成2mM的工作液。SAM在pH7～8 37℃条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免SAM降解，该工作液需要保存于冰上。
RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的RNA进行纯化并溶解于RNase-free水中不能将RNA溶解在EDTA溶液或其他盐溶液中。 - RNA二级结构：一些RNA转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构）），如二级结构发生在转录本的5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热RNA可以去除转录产物5'端的二级结构如果转录产物的5'端结构复杂，可以把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min。
- Cap 0-和Cap 1-mRNA： Cap 0-和Cap 1-mRNA之间的差异在RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸（N1是否具有2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1结构提高了mRNA的翻译效率。
本试剂盒的加帽反应可以与2'-O-甲基转移酶(货号：JN3051)在一个体系内同时工作产生Cap 1结构。当使用新的细胞系或翻译系统时，建议比较Cap 0-和Cap 1-mRNA翻译效率和免疫原性，以确定最佳的帽子结构。 - Poly(A)尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用百奥莱博E.coli Poly(A) Polymerase(货号：JN3052)进行加尾。加帽和加尾后的RNA需在进行RNA转染实验前做纯化处理。
- RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入0.5μL百奥莱博RNase抑制剂(货号：JN0013)，同时去掉等体积的RNase-free水。
- RNA5’端标记：在用于RNA 5'端标记时，GTP储备液应稀释到mRNA浓度的1～3倍。
Vaccinia Capping Enzyme催化三种酶促反应：
- RNA三磷酸酶将RNA 5'-三磷酸裂解为二磷酸。
pppN1(p)Nx-OH(3') → ppN1(pN)x-OH(3') + Pi - RNA鸟苷酸转移酶将GTP连接到RNA N1的5'-二磷酸。
ppN1(pN)x-OH(3') + GTP → G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi - 鸟嘌呤7-甲基转移酶，使用S-腺苷甲硫氨酸作为辅助因子，催化鸟嘌呤的7-氮甲基化。
G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc
- 加帽反应
本步骤适用于10μg RNA（≥100nt）的加帽反应，且可根据实验需要放大。- 用RNase Free Water将适量RNA稀释至15μL。
- 将RNA置于65℃加热5min，结束后冰上放置5min。
- 将32mM SAM稀释至2mM。
- 依次加入以下各组分：
成分 用量(20μL体系) Denatured RNA 15μL 10×Capping Reaction Buffer 2μL GTP (10mM) 1μL SAM (2mM) 1μL Vaccinia Capping Enzyme (10U/μL) 1μL - 37℃反应30分钟。RNA加帽完成，可进行后续Cap1修饰或加尾等实验。
- 用RNase Free Water将适量RNA稀释至15μL。
- 5'末端标记反应
本步骤适用于5'末端带有三磷酸的RNA标记，且可根据实验需要放大。其标记效率受反应体系中RNA与GTP摩尔浓度比以及RNA样本中GTP含量影响。- 用RNase Free Water将适量RNA稀释至14μL。
- 将RNA置于65℃加热5分钟，结束后冰上放置5min。
- 将32mM SAM稀释至2mM。
- 依次加入以下各组分：
成分 用量(20μL体系) Denatured RNA 14μL 10x Capping Reaction Buffer 2μL GTP mix 2μL SAM (2mM) 1μL Vaccinia Capping Enzyme(10U/μL) 1μL
注：GTP mix为GTP和少量标记物，GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1～3倍。 - 37℃反应30分钟。
- 用RNase Free Water将适量RNA稀释至14μL。
- 加帽效率低有哪些原因及解决方法？
- 在加帽反应之前，应将IVT产生的RNA纯化去除残留蛋白质，污染物和未结合核苷酸并溶解在RNase-free水中不能将RNA溶解在EDTA或其他盐溶液中
- SAM在室温下会慢慢降解，需始终放置在冰上，由于SAM的降解导致的N7甲基化效率低会进一步导致加帽失败。
- 可以适当增加RNA热变性的条件，把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min
- 某些RNA会在5'末端形成稳定结构（如同源二聚体，发卡结构），限制加帽酶靠近。分析序列后可以将RNA变性温度增加。如5'末端高度结构化，需要通过分子生物学技术来修改序列。通常可以通过在转录RNA（非编码区）的DNA模板前5个碱基中进行单点突变来实现。
- 在加帽反应之前，应将IVT产生的RNA纯化去除残留蛋白质，污染物和未结合核苷酸并溶解在RNase-free水中不能将RNA溶解在EDTA或其他盐溶液中
- 缓冲液出现白色沉淀如何解决？
- 将反应缓冲液在37℃孵育5min，彻底混匀以溶解沉淀物。
- 不要将试剂盒储存在-70℃。
- 将反应缓冲液在37℃孵育5min，彻底混匀以溶解沉淀物。
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